Sovrapposizione degli spettri di emissione di fluorocromi

Un esempio di sovrapposizione spettrale può essere osservata tra FITC e PE. La fluorescenza causata dal FITC durante una singola procedura di colorazione deve essere sottratta o compensata dal canale del PE.

Come viene eseguita una compensazione?
• Impostare il  voltaggio dei PMT.
• Rilevare l’autofluorescenza per ogni fluorocromo nel pannello.
• impostare i controlli a singolo colore per ogni fluorocromo nel pannello.

Quali possono essere i controlli a singolo colore?
• Le cellule
• Biglie di compensazione

Mentre le cellule possono sembrare una buona scelta, le biglie sono una valida alternativa, quando le cellule possono essere limitate o l'antigene di interesse è espresso a bassi livelli.

Punti di compensazione da considerare:
• Sempre preparare un tubo di cellule non colorate per settare i voltaggi dei PMT.
• Non utilizzare un tubo di biglie negative per impostare i voltaggi.

Lo spettro del CD4 PE si riversa pesantemente nel canale del PerCP-eFluor 710   Man mano che la compensazione viene applicate il sengale del PE nel canale del PerCP-eFluor 710 si riduce.                           La compensazione corretta si ottiene quando le popolazioni positive e negative per il PE hanno la stessa intensità media equivalente di fluorescenza (MFI) rispetto al PerCP-eFluor 710.

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